Pengertian Kloning Gen
Penentuan sekuen DNA bertujuan untuk memastikan fragmen DNA yang kita isolasi adalah gen target sesuai dengan kehendak kita. Gen target yang kita peroleh selanjutnya kita klon dalam sebuah vektor (plasmid, phage atau cosmid) melalui teknologi DNA rekombinan yang selanjutnya membentuk molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan yang dihasilkan kemudian ditransformasi ke dalam sel inang (biasanya sel bakteri, misalnya strain E. coli) untuk diproduksi lebih banyak. Gen-Gen target yang ada di dalam sel inang jika diekspresikan akan mengahasilkan produk gen yang kita inginkan.
Lahirnya gen kloning
Sekitar satu abad lalu, Gregor Mandel merumuskan aturan-aturan menerangkan pewarisan sifat-sifat biologis. Sifat-sifat organisme yang dapat diwariskan diatur oleh suatu faktor yang disebut gen, yaitu suatu partikel yang berada di suatu di dalam sel, tepatnya di dalam kromosom. Gen menjadi dasar dalam pengembangan penelitian genetika meliputi pemetaan gen, menganalisis posisi gen pada kromosom. Suatu penelitian yang merupakan revolusi dalam biologi medern adalah setelah munculnya metode teknologi DNA rekombinasi atau rekayasa genetika yang inti prosesnya adalah kloning gen, yaitu suatu prosedur untuk memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal (Anonimus b).
Tujuan Mengklon Gen
a. Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
b. Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut
c. Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut
d. Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit
bawaan
e. Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin,
ketahanan terhadap hama, dll.
Sumber DNA (gen) untuk diklon
1) DNA kromosom
2) cDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan
(template)
3) DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCRPolymerase Chain Reaction)
Bahan / Alat untuk Mengklon
a .Enzim endonuklease restriksi
b. Enzim ligase
c. Vektors
d. Inang (Host)
e. Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
Vektor (wahana) untuk Mengklon
Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor YACs dan YEps dapat digunakan pada khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40, dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.
Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut
a. Plasmid
Plasmid adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosomal) yag mengadakan replikasi secara automum didalam sel bakteri .secara alami plasmik mengandung gen-gen bagi resistensi terhadap antibiotik, faktor-faktor virulensi penyakit dan protein-protein transfer gen. DNAnya berbentuk lingkaran dan beruntai dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida itu maupun fungsi lain yang dipikul oleh plasmida. DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad.Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular.Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain. Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:
a. Replikator (origin of replication)
b. Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
c. Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang
menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau
penanda
Vektor berupa Plasmid
1. Memiliki origin of replicationdari inang yang dituju, sehingga memungkinkan replikasi
secara independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asing
3. Ketahanan terhadap antibiotik ganda
4. Penapisan biru-putih
5. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, MCS)
6. Mudah diisolasi dari sel inang.
Dua di antara wahana plasmida yang digunakan untuk mengkloning molekuler adalah Psc101 dan pBR322.Kedua tipe tersebut merupakan tipe nonkonjugal dan setiap sel E. coli merupakan contoh episom.Plasmid Pbr322 pada hakeketnya diturunkan dari pSC101, plasmid tersebut mengandung gen-gen resistensi bagi antibiotik tetrasiklik dan ampisilin.Salah satu masalah dengan vektor plasmid adalah bahwa insersi DNA yang bisa dikandungnya yang berukuran kecil (< 5-8 kb).Sedangkan vektor yang lainya lebih dari 10- 50 kb.
b. Bakteriofag (l phage)
Bakteriofag adalah virus yang menginfeksi bakteri digunakan jika kita sedang mengacu pada spesies yang berbeda (misal fag-fag lambda dan T4).Fag-fag memiliki kapsid ikosahedral yang berbentuk kira-kira speris dan dilekati oleh ekor yang pendek dan ada yang panjang, kontraktil maupun non kontraktil. Materi genetik kebanyakan fag adalah DNA untai ganda (dsDNA).
Daerah fag lambda mengandung gen-gen yang terlibat dalam dan dimulai dan dipertahankan kondisi lisogenik dan bisa digantikan oleh DNA asing hasil insersi jika ukuranya 20 kb dan tetap memungkinkan DNA fag untuk dikemas ske dalam kepala fag. Daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri.Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning yaitu bakteriofag 1 dan bakteriofag M13
c.Vektor Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l).kosmid bisa diperbanyak dalam sel-sel bakteri atau dipurikasi melalui pengepakan invitro ke dalam fag. Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA l dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan dari padafagdanplasmid.
d. Fasmid
Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakan gabungan antara plasmid dan fag l. Vektor yang dinamakan fasmid ini membawa segmen DNA l yang berisi tempat att. Tempat att digunakan oleh DNA l untuk berintegrasi dengan kromosom sel inangpadafaselisogenik.
e. Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens.
Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut plasmid Ti (tumor inducing atau penyebab tumor). Bakteri A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya padi. Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti, yang disebut T-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya, akan terbentuk tumor atau crown gall. Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan dieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman.
Dalam prakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun, ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi dengan DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel bakteri A. tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E.coli. Selanjutnya, plasmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel A. tumefaciens yang membawa plasmid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.
Baculovirus merupakan virus yang menginfeksi serangga. Salah satu protein penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang akan terakumulasi dalam jumlah sangat besar di dalam nuklei sel-sel serangga yang diinfeksi karena gen tersebut mempunyai promoter yang sangat aktif. Promoter ini dapat digunakan untuk memacu overekspresi gen-gen asing yang diklon ke dalam genom bacilovirus sehingga akan diperoleh produk protein yang sangat banyak jumlahnya di dalam kultur sel-sel serangga yang terinfeksi.
f. Vektor Kloning pada Mamalia.
Vektor untuk melakukan kloning pada sel-sel mamalia juga dikonstruksi atas dasar genom virus. Salah satu di antaranya yang telah cukup lama dikenal adalah SV40, yang menginfeksi berbagai spesies mamalia. Genom SV40 panjangnya hanya 5,2 kb. Genom ini mengalami kesulitan dalam pengepakan (packaging) sehingga pemanfaatan SV40 untuk mentransfer fragmen–fragmen berukuran besar menjadi terbatas.
Retrovirus mempunyai genom berupa RNA untai tunggal yang ditranskripsi balik menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi. DNA ini kemudian terintegrasi dengan stabil ke dalam genom sel mamalia inang sehingga retrovirus telah digunakan sebagai vektor dalam terapi gen. Retrovirus mempunyai beberapa promoter yang kuat.
0 Response to "Kloning Gen"
Post a Comment